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组织透明化与锘海LS18平铺光片显微镜技术在阿尔兹海默病研究中的最新应用

发布日期:2020/9/29 13:32:31

每年的9月21日是“世界阿尔茨海默病日”。目前,全世界约有4000万痴呆症患者,其中大部分为阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease, 简称为AD)患者。我国约有1000万AD患者,存在高患病率、低知晓率、低诊断率和低治疗率的“一高三低”状况。


细胞外β淀粉样蛋白沉积和细胞内tau蛋白磷酸化是AD的主要病理特征,异常的神经活动可以加剧AD的病理发展并破坏与高等认知功能相关的神经环路 。反之,通过调控一些神经活动也被证实可以减缓AD病情。2019年,来自麻省理工学院的Martorell等人在《细胞》杂志刊登的文章中【1】,使用伽马共振感官刺激(gamma entrainment usingsensory stimuli, 简称为GENUS)对5XFAD阿尔兹海默病模型小鼠进行干预。他们发现,听觉GENUS使用音频诱导小鼠听觉皮层(AC)和海马CA1区产生伽马频率的神经活动可以促进空间和认知记忆,并减轻相应区域的淀粉样蛋白沉积。听觉GENUS还引起相应区域的小胶质细胞活化和血管扩张反应,并在Tau P301S小鼠模型中减少了Tau蛋白磷酸化。而同时使用40Hz的视觉+听觉GENUS(不能只是二者之一)更进一步地使腹内侧前额叶皮层产生胶质细胞反应。为了更广泛地探寻GENUS对于模型小鼠产生的作用,文章作者采用SHIELD方法对小鼠整脑厚切片进行了透明化处理,通过三维光片荧光显微整脑成像和数据分析揭示出为期一周的视觉+听觉GENUS让小鼠整个新皮质中的淀粉样蛋白负荷体积减少了37%,数量减少了34%(图一)。GENUS这种无创性的干预方法在病理和行为两方面缓解了AD模式动物的症状,是否能运用于人类还有待进一步证实。


图一:经过SHIELD透明化处理的6月龄5XFAD小鼠整脑25um矢状面厚切片(G为无干预对照,H为视觉+听觉GENUS干预),使用anti-Aβ plaques抗体免疫染色。



SHIELD透明化技术及光片荧光显微成像技术简介

神经系统是结构与功能复杂的人体系统,成百上千种不同类型的细胞形成繁复的神经回路与网络,让人们难以从二维切片获取足够的信息来进行研究。近年来,组织透明化技术与平面光片照明显微镜的结合,让完整的脑、脊髓三维成像变为可能【2】。研究者利用这些技术可以更好地探索神经系统的发育、成熟、创伤和退变过程中的结构与功能变化。


SHIELD方法【3】以保护荧光蛋白构象为出发点,对主动式组织透明化技术进行了优化,与采取有机溶剂的组织透明化(BABB, iDisco, uDisco, 3DISCO, vDISCO等)相比,具有更好的荧光保护效果,并且比被动式亲水试剂透明化大大提高了处理速度(小鼠整脑透明化时间为3天),同时对于组织内核酸的保留使后续免疫杂交分析成为可能。


与传统的基于落射荧光的成像技术不同,选择性平面照明显微镜(Selective plane illumination microscopy (SPIM))将照明平面光片限制在检测焦平面附近,通过正交的照明光路与检测光路获取更好、更快的三维成像能力【4】。由于光的衍射,一片薄而大,同时又具有良好光约束能力的光片只存在于理想中。因此,在面对不同的成像需求,特别是亚微米级到厘米级的多细胞大样本成像时,空间分辨率、光学层析能力和视场大小三者不可兼得成为限制常规选择性平面照明显微镜三维成像能力的根本桎梏。平铺光片技术是一种新型的平面光片照明显微技术,通过对空间光调制器加载不同的相位图实现快速平铺短而薄的光片,从而达到扩大视场且不影响空间分辨率和光学层析能力,并获取在视野范围内各处成像分辨率均一的高分辨率图像的目的【5】。利用独特的平铺光片技术,我们可以对经过透明化处理的大组织(包括整脑)进行高分辨三维成像,并对成像结果进行三维数据渲染和分析。以下是平铺光片显微镜对SHIELD透明化方法处理的神经系统组织的三维成像实例:


THY1-GFP小鼠脑经过SHIELD透明化处理,使用LS18成像,放大倍数6.3X。




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参考文献:


【1】Martorell AJ, Paulson AL, Suk HJ, et al. Multi-sensoryGamma Stimulation Ameliorates Alzheimer's-Associated Pathology and ImprovesCognition. Cell. 2019;177(2):256-271.e22.

【2】Ueda HR, Ertürk A, Chung K, et al. Tissue clearing andits applications in neuroscience [published correction appears in Nat RevNeurosci. 2020 May;21(5):298]. Nat Rev Neurosci. 2020;21(2):61-79.

【3】Park YG, Sohn CH, Chen R, et al. Protection of tissuephysicochemical properties using polyfunctional crosslinkers [published onlineahead of print, 2018 Dec 17]. Nat Biotechnol. 2018;10.1038/nbt.4281.

【4】Gao L. Optimization of the excitation light sheet inselective plane illumination microscopy. Biomed Opt Express. 2015;6(3):881-890.

【5】Fu Q, Martin BL, Matus DQ, Gao L. Imaging multicellularspecimens with real-time optimized tiling light-sheet selective planeillumination microscopy. Nat Commun. 2016;7:11088.


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