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透明DISCO:透明化方法的缩写里究竟藏着多少秘密之第一期

Date:2021/5/18 9:28:43




大家都知道时尚界里有CHANEL,却不一定知道透明化界里有个SHANEL吧?

很多人都看过神盾局(S.H.I.E.L.D.),却不一定听过SHIELD透明化方法。

神曲《野狼Disco》能不断传染快乐,透明化大法“DISCO”的各种版本却能让刚接触实验的童鞋们抓狂到底该用哪一种:

建好的模,我想要把你看透

在那深夜Lab,哪管它是油性水性

让摇床尽情摇摆,使试剂更快渗透

透明的法哪家强,你知道吗





 

言归正传,小编准备着手从透明化方法的缩写里找出它们的秘密所在,开篇就从版本众多的《透明DISCO》开始,以下按时间线进行梳理。


1. BABB (Dodt et al., 2007)


如果要开讲各种“DISCO”方法,必然绕不开BABB。2007年,德国Hans-Ulrich Dodt等人报道,利用BABB透明化技术可以用细胞分辨率对固定的小鼠脑进行光学切片成像,并可用于检测小鼠海马中单个GFP标记的神经元。BABB的缩写源自实验方法中采用苯甲醇(BA)苯甲酸苄酯(BB)(以1:2配比)作为透明化溶剂。尽管BABB所采用的有机溶剂会快速淬灭荧光,但并未妨碍在它基础上衍生出了各种强大而有效的透明化方法。


经过BABB透明化的局部海马区3D重构(Dodt et al., 2007)



2. 3DISCO(Ertürk et al., 2012)


为了改进BABB对荧光信号的淬灭问题,同样还是由Dodt研究组通过引入四氢呋喃(THF)和二苄醚(DBE)联用取代BABB,能够实现大多数成年啮齿动物器官的高度透明,并延长荧光蛋白信号至几天,此外还能够透明化有髓组织以便进行中枢神经系统(CNS)相关研究。3DISCO的命名源自“3D imaging of solvent-cleared organs”的英文缩写,即基于有机溶剂透明化的器官三维成像。但正是由于有机溶剂的存在,荧光信号的保留时间过短需要在透明化后尽快成像,此外,一些荧光团(如YFP)在透明化溶剂中的稳定性较差,因而需要选择标记强的荧光团。


利用3DISCO方法及Lectin-FITC标记示踪野生型小鼠脊髓血管系统(Ertürk et al., 2012)

 


3. iDISCO(Renier et al., 2014)


由于有限的抗体渗透性,大组织或器官的免疫标记向来是透明化样本进行分子结构三维可视化的巨大难题。Renier等人开发了一种简单、快速、低成本的方法,称为“immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs”,简称“iDISCO”。研究团队还指出,如果一种抗体在组织切片的免疫组化(IHC)中提供良好的信号和低背景,根据经验表明它很有可能与iDISCO方法兼容:实验中测试了28种在免疫组化中表现良好的抗体,都能在iDISCO中成功工作。


小鼠胚胎采用iDISCO免疫标记TrkA(Renier et al., 2014)



4. uDISCO(Pan et al., 2014)


大组织中的光散射以及标准光片显微镜成像样品的尺寸限制了分析大样本,如整个啮齿动物的身体。Ertürk研究组在3DISCO的基础上,打破了大组织成像的限制,开发了“终极DISCO”(ultimate DISCO)方法,使完整的器官和啮齿动物的全身透明,并可以保存荧光蛋白至数月之久。


大鼠全身透明化后的整个中枢神经系统(脑连脊髓)成像(Pan et al., 2014)




5. iDISCO+(Renier et al., 2016)


Renier等人在2016年又推出了iDISCO+版本(此法无缩写,就是iDISCO plus版),在免疫染色前加入了二氯甲烷(DCM)/甲醇(MeOH)预处理步骤,在不影响表位的情况下有助于减少背景和改善抗体扩散,而且DCM/MeOH组合有效减轻了老版本中采用THF脱水而造成的较严重的收缩现象,因此有利于与标准脑图谱进行自动配准及进一步分析。


iDISCO+和ClearMap对c-FOS抗体标记信号的分析流程(Renier et al., 2016)

 


6. a-uDISCO(Li et al., 2018b)


a-uDISCO是uDISCO的改良版,旨在实现更好的荧光保存,光学成像质量得到了进一步提高。Li等人通过调节pH条件提高了荧光强度和稳定性,故而命名为“a-uDISCO” (alkaline

pH-based uDISCO)。研究证明a-uDISCO能够高质量对全脑神经元结构进行三维可视化。


a-uDISCO和uDISCO透明化及三维可视化结果对比(Li et al., 2018b)


 

7. FDISCO(Qi et al., 2019)


3DISCO导致内源荧光的快速淬灭阻碍了它的应用,Qi等人开发了一种基于3DISCO的透明化方法,通过调节温度和pH,可以实现各种探针的高水平荧光保存,如荧光蛋白和化学荧光示踪剂,处理时间短,同时保持强大的组织透明化能力。此外研究组检测了全脑弱标记的病毒神经元,并分析了投射到病毒注射区域的细胞空间分布。就如其名称所言 “DISCO with superior fluorescence preserving capability”,FDISCO就是具有优越的荧光保存能力的DISCO。


通过双AAV标记从左右初级运动皮质追踪下行运动轴突(Qi et al., 2019)

 


8. sDISCO(Hahn et al., 2019)


Dodt研究团队“王者归来”,开发的sDISCO(stabilised DISCO)透明化方法,通过添加抗氧化剂没食子酸丙酯(propyl gallate)来稳定纯化的DBE或BABB,可以有效地保存EGFP表达样本中的荧光信号长达一年以上


透明化 1个月后3DISCO和sDISCO荧光信号的对比(Hahn et al., 2019)





9. vDISCO(Cai et al., 2019)


vDISCO是由Ertürk研究组开发的,一种压力驱动的,基于纳米抗体的全身免疫标记技术(nanobody(VHH)-boosted 3D imaging of solvent cleared organs),并将FPs的信号强度提高了100倍以上。该技术能够透过骨骼,皮肤对完整透明的小鼠进行亚细胞水平成像和量化,在Thy1-GFP-M小鼠中看到全身神经元投射。此外,vDISCO清楚显示颅骨与脑膜之间的血管连接


Thy1-GFP-M小鼠全身神经元投射(Cai et al., 2019)


颅骨脑膜连接(SMCs)(Cai et al., 2019)

 


10. m-iDISCO(Li et al., 2020)


m-iDISCO(modified iDISCO)是iDISCO的改良版,Li等人最新又开发一种改进的iDISCO方法,在透明化前通过引入ScaleCUBIC-1试剂进行预处理。该方法可以消除非特异性染色,利用小鼠抗神经纤维抗体对不同肌肉中的神经纤维进行均匀、完整的标记,实现骨骼肌中神经的三维可视化


iDISCO和m-iDISCO神经纤维标记结果对比(Li et al., 2020)

 

 

整理下来发现DISCO透明化方法竟然有10种之多,除了样本有不同程度的收缩、试剂比较毒、还未解决与某些特定示踪剂(如DiI)兼容性等有机溶剂型方法常见的缺点外,涵盖从小鼠胚胎、到各个组织器官再到全身,并对荧光信号的保存和免疫标记在不断地在优化,“实在是三维成像必备良方”。

 



参考文献

1. Dodt HU, Leischner U, Schierloh A, et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 2007;4(4):331-336.

2. Ertürk A, Becker K, J?hrling N, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7(11):1983-1995.

3. Renier N, Wu Z, Simon DJ, Yang J, Ariel P, Tessier-Lavigne M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 2014;159(4):896-910.

4. Pan C, Cai R, Quacquarelli FP, et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 2016;13(10):859-867.

5. Renier N, Adams EL, Kirst C, et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 2016;165(7):1789-1802.

6. Li Y, Xu J, Wan P, Yu T, Zhu D. Optimization of GFP Fluorescence Preservation by a Modified uDISCO Clearing Protocol. Front Neuroanat. 2018;12:67.

7. Qi Y, Yu T, Xu J, et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Sci Adv. 2019;5(1):eaau8355.

8. Hahn C, Becker K, Saghafi S, et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). J Biophotonics. 2019;12(8):e201800368.

9. Cai R, Pan C, Ghasemigharagoz A, et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nat Neurosci. 2019;22(2):317-327.

10. Li Y, Xu J, Zhu J, Yu T, Zhu D. Three-dimensional visualization of intramuscular innervation in intact adult skeletal muscle by a modified iDISCO method. Neurophotonics. 2020;7(1):015003.



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